YY/T 1888-2023《重组人源化胶原蛋白》医疗器械行业标准

YY/T 1888-2023《重组人源化胶原蛋白》医疗器械行业标准已经审定通过，现予以公布。标准编号、名称、适用范围和实施日期见附件。

重组人源化胶原蛋白

1范围

本文件规定了重组人源化胶原蛋白的质量控制、技术要求、试验方法、包装、运输和贮存等。

本文件适用于作为医疗器械原材料的重组人源化胶原蛋白的质量控制。

注：本文件中验证的样品是基于重组III型人源化胶原蛋白材料。其它重组人源化胶原蛋白原材料如适用，可参考本文件。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB仃16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验

GB仃16886.20医疗器械生物学评价第20部分医疗器械免疫毒理学试验原则和方法

YY/T 1465医疗器械免疫原性评价方法

YY/T 1849-2022 重组胶原蛋白

中华人民共和国药典（2020年版）

3术语和定义

YY/T 1849-2022界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

重组人源化胶原蛋白Recombinant humanized collagen protein

由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合⑴。

3.2

人胶原蛋白型别Human collagen types

人胶原蛋白在遗传学上可以分为二十余种不同的型别，其氨基酸序列，分子组装形式或组织分布特征存在差异。不同型别的人胶原蛋白一般由罗马数字依次命名，比如human Type 1 collagen表示人I型胶原蛋白。每个型别的人胶原蛋白由1条或多条的胶原蛋白基因编码组装而成，比如人1型胶原蛋白由人C OL1A1和C OL1A2基因编码组装而成。

人胶原蛋白片段Humancollagenfragment

位于同一条人胶原蛋白氨基酸序列内具有一定天然连续长度的氨基酸序列片段。

注：研究文献显示，人胶原蛋白序列中一般需具备天然连续21个氨基酸片段才能形成稳定的结构等

4质量控制

由于重组人源化胶原蛋白所选人胶原蛋白型别和氨基酸序列片段不同，表达体系的差异，氨基酸序列和理化性质差异较大。需建立适宜的方法对不同批次间的产品进行质量控制，包括釆用参比品和经验证的方法评估己知（或）潜在的成品相关物质和对工艺相关物质进行鉴别、理化、纯度、杂质等检测分析。

参比品应选择已证明足够稳定或用一个代表性批次作为参比品，用于鉴别、理化、结构表征等各种分析，参比品应进行必要的分析鉴定，应参照《中华人民共和国药典》“生物制品国家标准物质制备和标定"的相关要求，宜对蛋白质含量、等电点、纯度、氮端氨基酸序列、分子量、肽图、指纹肽图谱库、二硫键分析及糖基（酵母或其它真核细胞表达）等进行分析。

用于理化测定等方面的参比品，如用于肽图或等电点测定的参比品，可用原液直接分装制备，一般-70°C以下或经验证的贮存条件下保存。

5技术要求

5.1通则

重组人源化胶原蛋白检测项目取决于原料来源、工艺验证、成品一致性、工艺添加物和相关杂质的水平。应当釆取适当方法对重组人源化胶原蛋白的质量进行检测验证，本技术要求适用的重组人源化胶原蛋白其型别应能够被明确，氨基酸序列应能够被检测，蛋白纯度应能够被测出。根据具体重组人源化胶原蛋白成品的特性，需要进行相应的特性分析，具体特性分析及检测项目包括如下几个方面。

5.2理化性质

5.2.1外观

应为白色/淡黄色/无色透明液体或凝胶，或白色/类白色冻干粉或海绵状固体。

注：随着行业发展，可能存在其他外观要求，应根据原材料具体形态规定外观要求。

5.2.2可见异物

应无明显异物。

5.2.3水溶解性/盐溶解性

水溶解性/盐溶解性应符合表1的规定。

表1水溶解性/盐溶解性要求

5.2.4水分

适用时（如冻干粉），水分含量应≤10%。

5.2.5炽灼残渣

适用时，应≤2.0%。

5.2.6酸碱度

适用时，酸碱度应在5.5-8.0之间。

5.2.7等电点

应符合YY/T1849-2022中5.3.4的规定。

5.2.8渗透压摩尔浓度

适用时，渗透压摩尔浓度应在280—360mOsmol/kg之间。

5.2.9总蛋白含量

应为标示量的80%〜120%。'

5.2.10纯度

纯度应＞95%。

5.2.11装量

单个装量不低于标示装量的93%,平均装量不低于标示装量。

5.3鉴别

5.3.1氨基酸序列确认

根据《重组胶原蛋白生物材料命名指导原则》对重组人源化胶原蛋白定义，重组人源化胶原蛋白是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。依据YY/T1849-2022中8.2的要求，企业应提供产品全部氨基酸序列用于人源化鉴别，包含胶原蛋白类型、氨基酸长度和编辑情况等信息。氨基酸序列从氮端和碳端应展示为人胶原蛋白某型序列的具体起止位点和编辑方式，例如用“人胶原蛋白1型alpha-1亚型(380G-641G)x2”表示人胶原蛋白I型alpha-1亚型380位到641位氨基酸直接连接重复两次。

注1：根据定义，重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列应全部由人胶原蛋白特定型别的氨基酸序列全长或片段组成，最终产品序列中排列顺序应与人胶原蛋白排列顺序一致，氮端、碳端和中部如果有人胶原蛋白以外的序列(如纯化标签、连接序列等)不适用于本标准。

注2：“部分氨基酸序列片段”通常指位于同一条人胶原蛋白氨基酸序列内具有-定天然连续长度的氨基酸序列片段。研究文献显示，人胶原蛋白序列中一般需具备天然连续21个氨基酸片段才能形成稳定的结构等*可：

5.3.2肽段覆盖率(氨基酸序列覆盖度)

根据理论序列进行对比，肽段覆盖率应为100%。

注：直接使用供试品检测。应选择适宜的蛋白酶进行酶解，酶解后应选择不小于5个连续氨基酸的片段为基本的序列单元进行覆盖分析。

5.3.3末端氨基酸序列

根据理论序列进行对比，应与设计的理论氨基酸序列一致。

注1：其结果应与设计的氨基酸序列完全一致。不应含有“重组人源化胶原蛋白”定义以外的序列，即不应含有除人胶原蛋白特定型别的氨基酸序列以外的其它氨基酸序列片段。

注2：样品检测前不应经过任何额外处理步骤。

5.3.4肽图

应与参比品肽图一致。

5.3.5分子量

应符合YY/T1849-2022中5.3.3的规定。

5.4杂质'污染物和添加剂

5.4.1外源性DNA残留量、宿主细胞蛋白残留量(大肠杆菌蛋白质残留量、酵母蛋白质残留量、CHO细胞蛋白质残留量)、肽聚糖及添加剂应符合YY/T1849-2022中5.5的规定：无菌、微生物限度应符合YY/T1849-2022中5.9.2和5.9.3的规定。

5.4.2重金属及微量元素含量

重金属及微量元素含量应符合以下规定：

a) 对工艺中添加的重金属元素，应符合规定值限；

b) 重金属总量(以Pb计)应<10gg/g：

c) 微量元素含量：碑(As)<1ng/g,汞(Hg)<4gg/g,铅(Pb)<10gg/g,絡(Cr)、镉(Cd)、铜(Cu)、钼Mo)、铁(Fe)、镍(Ni)总量应≤50mg/g。

5.4.3残余抗生素含量

应≤50ng/mg。

5.4.4残余抗生素活性

应无残余抗生素活性。

5.4.5细菌内毒素

应符合YY/T1849-2022中5.9.3的规定。

5.5结构表征

5.5.1氨基酸异质性分析

5.5.1.1脱酰胺化、氧化、糖谱/糖基化修饰等

适用时，应按YY/T1849-2022中5.7.1的要求进行分析。

5.5.1.2脯氨酸羟基化

适用时，应符合YY/T1849-2022中5.7.7的规定。

5.5.2高级结构分析

应釆用多种方法对重组人源化胶原蛋白高级结构进行研究分析，包括以下列举的方法及其他结构表征方法（如冷冻电镜、蛋白质晶体结构等方法）。

5.5.2.1圆二色（CD）光谱

适用时，重组人源化胶原蛋白的CD谱图应在195nm附近有负峰，在221nm附近有正峰。

注：应标示样品的实验检测条件，可按照YY/T1849-2022中5.7.4描述的方法进行分析。

5.522微量差示扫描量热谱

适用时，样品吸收峰（Tm值）应与参比品吸收峰（Tm值）基本一致，偏差应在±6°C之间。

注：应标示样品的实验检测条件，在实验条件下有吸收峰表明有结构的变化。

5.523红外光谱

适用时，红外光谱图的非特征区（如：酰胺a、b）和特征区（如:酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置应与参比品一致。波数偏差应在±0.5%cm』之间。

5.5.2.4拉曼光谱

样品的拉曼光谱图应与参比品一致。

6试验方法

6.1理化性质

6.1.1外观

用肉眼直接观察，结果应符合5.2.1的规定。

6.1.2可见异物

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0904可见异物检查法第一法（灯检法）进行检测，结果应符合5.2.2的规定。

6.1.3水溶解性/盐溶解性

称取适量样品，溶解于25°C±2°C一定体积的溶剂中，每隔5min强力振摇30s；观察30min内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解。结果应符合5.2.3的规定。

注：本文件规定的盐溶解性为pH7.4的PBS溶液溶解。

6.1.4水分

除另有规定外，取样品1.0〜2.0g,按照YY/T1849-2022中5.2.4中描述的方法进行检测，结果应符合5.2.4的规定。

6.1.5炽灼残渣

除另有规定外，取样品1.0-2.0g,按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0841炽灼残渣检查法进行检测，结果应符合5.2.5的规定。

6.1.6酸碱度

液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为lmg/mL按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0631pH值测定法进行检测，结果应符合5.2.6的规定。

6.1.7等电点

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0541电泳法第六法（等电聚焦电泳法）或0542毛细管电泳法进行检测，结果应符合5.2.7的规定。

6.1.8渗透压摩尔浓度

液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为lmg/mL按照《中华人民共和国药典》

2020年版四部通则0632渗透压摩尔浓度测定法进行检测，结果应符合5.2.8的规定。

6.1.9总蛋白含量

总蛋白含量的测定按照YY/T1849-2022中5.6描述的方法进行检测，结果应符合5.2.9的规定。

6.1.10纯度

6.1.10.1色谱法

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0521高效液相色谱法或0514分子排阻色谱法进行检测，按面积归一化法计算纯度，其结果应符合5.2.10规定。

6.1.10.2电泳法

按照YY/T1849-2022中5.4.1描述的方法进行检测，其结果应符合5.2.10规定。

6.1.11装量

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0942最低装量检查法进行检测，结果应符合5.2.11的规定。

6.2鉴别

6.2.1氨基酸序列确认

根据企业提供的产品氨基酸序列，将氨基酸序列与人胶原蛋白数据库进行比对，如NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）,比对结果应符合5.3.1的规定。

6.2.2肽段覆盖率（氨基酸序列覆盖度）

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0431质谱法进行检测，分析结果应符合5.3.2的规定。

肽段覆盖率（氨基酸序列覆盖度）（％）=（鉴定肽段的氨基酸个数/理论氨基酸个数）X100%。

注1：肽段覆盖率是指检测到的肽段的氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例。蛋白质经过酶切后，釆用LC-MS进行检测，鉴定到的酶切后肽段占理论序列氨基酸数量的比例。.

注2：应直接使用供试品进行酶切，不得使用电泳跑胶后切胶，且酶解后应釆用不小于5个连续氨基酸的片段为基本的序列单元，同时应不含有任何非人源胶原蛋白的序列片段。

注3：如胰蛋白酶或一种酶不能水解，选择适宜的其他蛋白酶，结合多种酶切的鉴定结果，进行肽段覆盖率计算。

6.2.3末端氨基酸序列

用氨基酸序列分析仪或质谱法测定氮端和/或碳端氨基酸序列，结果应符合5.3.3的规定。

注1：应直接使用供试品或者取供试品溶解后直接上样。

注2：每年应至少检测一次。

6.2.4肽图

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则3405肽图检查法第一法（胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法）进行检测，结果应符合5.3.4的规定。

注：如胰蛋白酶不能水解.选择适宜的其他蛋白酶。

6.2.5分子

按照YY/T1849-2022中5.3.3描述的方法进行检测，其结果应符合5.3.5规定。

6.3杂质'污染物和添加剂

6.3.1外源性DNA残留量

按照YY/T1849-2022中5.5.2描述的方法进行检测，结果应符合5.4.1的规定。

6.3.2.1大肠杆菌蛋白质残留

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则3412大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行检测，结果应符合5.4.1的规定。

63.2.2酵母蛋白质残留量

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则3414酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行检测，结果应符合5.4.1的规定。

632.3CHO细胞蛋白质残留量

采用经验证的酶联免疫试剂盒进行检测，结果应符合5.4.1的规定。

6.3.3肽聚糖

若重组人源化胶原蛋白的生产过程有可能引入肽聚糖(促炎性污染物)的风险，釆用经验证的方法或经验证的市售细菌肽聚糖检测试剂盒(ELISA)进行检测，结果应符合5.4.1的规定。

6.3.4添加剂含量

如果使用了防腐剂、冻干保护剂等添加剂应给出相应的检测方法，按给出的检测方法进行检测，结果应符合5.4.1的规定。

6.3.5无菌

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1101无菌检査法进行检测，结果应符合5.4.1的规定。

6.3.6微生物限度

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法和1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法进行检测，结果应符合5.4.1规定。

6.3.7重金属及微■元素含量

6.3.7.1重金属总量

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0821重金属检查法进行检测，结果应符合5.4.2的规定。

63.7.2微量元素含量

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0406原子吸收分光光度法、0411电感耦合等离子体原子发射光谱法或0412电感耦合等离子体质谱法进行检测，结果应符合5.4.2的规定。

6.3.8残余抗生素含量

残余抗生素含量的测定按照YY/T1849-2022中5.5.6描述的方法或其他经验证的方法进行检测，

6.3.9残余抗生素活性

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1200生物活性测定法中1201抗生素微生物检定法或《中华人民共和国药典》2020年版四部通则3408抗生素残留量检查法进行检测，结果应符合544的规定。

6.3.10细菌内毒素

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1143细菌内毒素检查法或9251细菌内毒素检查法应用指导原则“重组C因子法”进行检测，结果应符合5.4.5规定。

6.4结构表征

6.4.1氨基酸异质性分析

6.4.1.1脱酰胺化、氧化、糖谱/糖基化修饰等

按照YY/T1849-2022中5.7.1和5.7.8描述的方法进行检测，结果应符合5.5.1.1的规定。

6.4.1.2脯氨酸羟基化分析

按照YY/T1849-2022中5.7.7描述的方法进行检测，结果应符合5.5.1.2的规定。

6.4.2高级结构分析

6.4.2.1圆二色(CD)光谱

按照附录A规定的方法进行检测，结果应符合5.5.2.1的规定。

6.4.2.2微量差示扫描量热谱

按照附录B进行检测，结果应符合5.5.2.2的规定。

6.4.23红外光谱

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0402红外分光光度法进行检测，结果应符合5.523的规定。

6.4.2.4拉曼光谱

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0421拉曼光谱法(建议入射光与所检测的拉曼散射光之间的夹角为0°或90。或180°)进行检测，结果应符合5.5.2.4的规定。

7稳定性

重组人源化胶原蛋白稳定性受多种因素影响，包括纯化工艺、微生物负载、包装贮存条件等。重组人源化胶原蛋白的稳定性变化，如降解，可能会直接影响预期用于医疗器械产品的安全性和有效性，因此，应对其稳定性进行动态评价和分析。与稳定性相关的工艺验证宜采用连续三批次重组人源化胶原蛋白进行。在工艺条件有变化时，应考虑对重组人源化胶原蛋白稳定性的影响，必要时进行再次验证。

8生物学评价

作为制备医疗器械产品的原材料，应按照GB/T16886.1的要求对重组人源化胶原蛋白进行相应必要的生物学评价，如预期用于植入产品的原材料，还应评估样品是否为内源性凝血系统激活物。

基于部分人胶原蛋白氨基酸序列进行编辑组合重组制备的蛋白质产物，特别是长期反复使用时,可能引起人体预测不到的免疫原性。需进行免疫学研究，试验方法可参照GB116886.20及YY/T1465系列标准。

重组人源化胶原蛋白作为医疗器械用原材料，可釆用适宜方法，进行免疫学评价。若用动物进行免疫学试验，可能因为动物模型与临床应用之间存在种属差异，带来对评价试验结果或评价试验数据使用上的局限，应当根据临床试验获得的免疫学评价数据及动物模型获得的免疫评价数据进行综合评价分析。

9包装、运输和贮存

应符合YY/T1849-2022中8.1、8.2的规定。

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